不同种类的PCR探针如何工作-水解探针

水解探针是 qPCR 标记的探针，用于通过互补靶向特定序列。水解探针由引物、荧光报告基因和淬灭剂组成，其中报告基因发出的荧光表明与目标序列对齐。

图 1. 水解探针的组成部分包括互补寡核苷酸或寡核苷酸序列（可与目标 DNA/RNA 序列杂交的小核苷酸序列）、荧光报告基因和猝灭剂。

寡核苷酸：用于 PCR 探针的寡核苷酸是与目标序列互补的 DNA 序列。

荧光报告基因：荧光报告基因是一种 5-荧光染料。一旦检测到目标序列并且它与猝灭剂分离，该分子就会发出荧光。发出绿色荧光的荧光素 (FAM) 通常用作荧光报告基因。

猝灭剂：猝灭剂是一种从荧光团吸收激发能的分子（消耗报告基因的荧光）。换句话说，淬灭剂附着在引物上，当它们非常接近时，它会从那里淬灭荧光团发出的荧光。常用的猝灭剂有 Black Hole Quencher 1 染料和 TAMRA。

水解探针如何工作？

在 qPCR 中，水解探针根据引物与目标序列结合。

然后，在延伸过程中，DNA 聚合酶启动聚合并对引物执行 5 → 3 核酸外切酶活性。

DNA 聚合酶从引物和猝灭剂中切下荧光报告基因。

然后，荧光报告基因和猝灭剂分离，游离荧光报告基因发出荧光。

图 2. 水解探针与互补序列结合。 聚合酶（紫色箭头）将荧光报告基因与探针分开，也将其与猝灭剂分开。 与淬灭剂的分离导致报告荧光。

水解探针的三个组成部分，引物、荧光报告剂和淬灭剂，连接在一起，并且它们的构型是精确的。

考虑一个可调节的运动重量。 两组杠铃被金属杆隔开。

图 3. 将 PCR 水解探针与哑铃进行比较。 哑铃条代表探针的寡核苷酸。 两个铃铛代表荧光报告基因和猝灭剂。

使用水解探针，将荧光报告基因和猝灭剂置于寡核苷酸的特定位点； 因此，淬灭剂总是淬灭来自报告基因的荧光，而寡核苷酸充当连接两个分子的桥梁。

这些水解探针具有高特异性等优点，因为寡核苷酸通过互补杂交与您的目标序列结合，并且能够进行多重反应。

您可以在同一反应中使用多种引物和荧光报告基因。