通常，在科学实验中，我们会对所研究的目的基因进行表达分析，常用的方法有实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）。有些做RNA-seq的小伙伴，在做完转录组分析之后，一般也都会要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。这里我们讲一下常用的Livak法(2^-[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct法)是如何计算的，以及在qRT-PCR中常见问题和解决方案。
qRT-PCR的原理：
以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比。通过实时检测PCR扩增过程中荧光信号的变化，可以获得关于相对定量基因表达水平的信息。qRT-PCR一般包括SYBR染料法和Taqman探针法。例如，SYBR染料游离时发出的荧光信号微乎其微，但当其与双链DNA的小沟结合后，荧光信号强度会大大增加，表明双链DNA总量也发生了很大变化。在qRT-PCR实验中，Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到预设阈值的周期数（cycle）。
扩增曲线及溶解曲线如下图所示：
扩增曲线主要用于评估扩增引物的效率。当使用引物特异性较好时，扩增曲线呈现出单一峰值，这样的实验结果更加可靠。
一、Livak法的详细步骤：
在这里，我们有一个对照组（wt），一个处理组（mut），还有一个内参基因（ATCB）和目的基因（OCA2），希望比较处理组与对照组中目标基因的相对表达差异，也就是计算2^-[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct，数据如下图所示：
1.计算每个组内参基因（ATCB）Ct值的均值
2.计算每组中待检目的基因的Ct值与内参基因的Ct值之差（即[gf]2206[/gf]Ct）
3.计算对照wt组中[gf]2206[/gf]Ct值的均值，然后将处理mu组中每个样本的[gf]2206[/gf]Ct值减去对照wt组的[gf]2206[/gf]Ct 均值，以得到[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct值
4.进行相对表达量计算，即将处理mu组相对于对照wt组的[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct值作为指数，并计算2的负幂次方（2^-[gf]2206[/gf][gf]2206[/gf]Ct）
二、常见问题和解决方案：
1、扩增曲线中Ct值出现过晚
cDNA模板降解或cDNA模板浓度低：Ct值越晚，表示内参基因和目的基因序列起始浓度越低。可以重新制备cDNA模板重复实验，以及减少cDNA模板稀释倍数重复实验。
扩增效率低：引物或探针的设计可能特异性不强，导致扩增效率低。确保引物或探针的设计准确，避免与非目标序列的非特异性结合。可以重新设计引物或者优化PCR反应条件，比如在qRT-PCR中使用三步法扩增程序。
PCR体系中存在抑制物：样品中可能存在PCR反应抑制物，如残余酚类物质、碳水化合物、盐（胍盐）等。这些抑制物可能会降低PCR效率，导致Ct值偏高。一般来说，纯度好的RNA，A260/ A280比值应大于2.0，如果比值低于2.0，则表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。确保在样品制备过程中使用纯净的试剂和采用可以提取高质量RNA的方法，以去除或稀释潜在的抑制物。
2、在qRT-PCR实验中，内参基因的Ct值正常，而目的基因的Ct值出现较晚
目的基因的表达水平较低：如果目的基因的表达水平较低，PCR扩增需要更长的时间才能达到设定的荧光阈值，因此Ct值会出现较晚。在这种情况下，为了准确测量目的基因的表达水平，内参基因的模板和目的基因的模板应该分开进行稀释（内参基因和目的基因都有其特定的浓度范围，过低或过高的浓度都可能导致结果的不准确性）。也可以使用数字PCR仪检测。
PCR扩增得率低：引物和目的基因序列之间的特异性匹配可能存在问题，导致扩增效率低。可以设计多对引物，从中选择最优的。
3、熔解曲线呈现非单一峰
非特异性扩增：当PCR反应条件不够好或引物与非目的基因序列匹配时，可能会导致非特异性扩增产物的形成。这种情况下，熔解曲线可能显示出多个峰。可通过优化PCR反应条件（进行温度梯度PCR实验，尝试不同温度和延伸时间）、根据引物设计原则来设计新的引物等方法以增加特异性。
引物二聚体：引物对之间的非特异性结合，导致在熔解曲线上出现额外的峰，通常位于75左右。在qRT-PCR反应结束后，可以通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。可以通过适当减低引物浓度以避免。
在qRT-PCR中有基因组污染：重新制备cDNA模板即可
4、实验重复性很差
移液枪不准，加样不准确：这种情况下，可以更换最佳使用量程的性能更好的移液枪，并定期对移液枪进行校准。
定量PCR仪在不同位置温度不一样：为获取准确的实验结果，定量PCR仪应定期进行校准。
qRT-PCR预混液未混合均匀：可以轻轻颠倒装有qRT-PCR预混液的离心管来促进混合。注意应避免剧烈摇动或振荡，以免引起气泡的形成。
以上提供的是qRT-PCR相对定量分析的详细步骤以及常见问题和解决方案，希望能对小伙伴们有所帮助！关注汉恒生物，如果您对于qRT-PCR实验还有任何疑问，都可以跟我联系！
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