详解修饰引物/探针—MGB探针

在上一期的栏目中，我们详细介绍了TaqMan荧光探针

它是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，3’端携带淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，探针被水解后，报告基团和淬灭基团分开时，报告基团发出的荧光就可以被检测到。

在此基础之上，于TaqMan探针的3’端加入一个能插入DNA小沟的小沟结合物（MGB），可以大大提高探针的Tm值，增加杂交反应的特异性，MGB探针5’端标记荧光基团，3’端标记不发荧光的淬灭基团NFQ，通过NFQ基团淬灭5端荧光报告基团产生的信号，避免传统淬灭基团产生的背景，降低荧光背景信号。此外其3’末端还连接一个小沟结合物MGB，他们组成的整体探针就是本期我们要介绍的MGB探针。

小沟结合物(Minor Groove Binder，MGB)是一种二氢环吡咯三肽，它可以选择性地结合到DNA分子的小沟，即DNA螺旋中的浅沟。MGB标记的寡核苷酸与互补的DNA和RNA靶序列形成稳定的杂合复合物。

注：此图为MGB探针示意图，图片下方MGB分子通过C-N键与探针偶联。

MGB探针优势

1. 特异性更强：由于探针中加入了MGB 部分，可以增加探针的熔解温度 (Tm) 10-15℃。这意味着 TaqMan MGB 探针可以比传统探针短很多，提供更好的序列鉴别能力和灵活性，可适应更多靶标，尤其适合SNP分型实验。

2. 荧光背景更低：MGB探针相较于普通TaqMan探针序列更短，因此荧光基团淬灭更加完全，从而降低荧光背景，提高信噪比;

3. 水解性能更高：MGB探针序列较短，PCR过程中更容易被完全水解，PCR效率高，荧光信号释放充分。

MGB探针设计原则

1. 探针的5’端避免出现G，因为5’端与报告基团相连，G碱基会淬灭荧光基团的荧光信号，在水解后即便只剩下1个G碱基与报告基团相连，该淬灭效果依然存在。

2. 尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。

3. 探针的Tm值应比引物Tm值高8-10°C，因加入MGB使得探针Tm增加10-15°C, 则探针序列的Tm值在50-55°C左右即可。

4. 尽量缩短MGB探针，以提高特异性，但探针长度不少于13 bp, 一般为13-17 bp。

5. 原则上MGB探针与目的片段只要有一个碱基不匹配，MGB探针则不会与目的片段结合，不会发生水解且无荧光信号。因此，在进行SNP检测时，为了检测到SNP位点，应将探针的SNP位点尽量放在中间部分，避免放在两端引起的非特异性退火。

MGB探针应用

MGB探针可适用于普通TaqMan探针应用的所有领域包括：科学研究、医药卫生和基因检测等方面的应用（TaqMan探针应用请看上一期文章）

由于MGB探针序列更短，更加特异，因此更加适用于SNP 基因分型、其他等位基因分型和对特异性要求较高的qPCR实验应用。

SNP分型案例分析

SNP分型使用MGB探针法，操作流程与普通荧光定量PCR扩增一致，不同的地方是体系中会含有针对不同基因型的探针，两种探针5’端通过标记不同的荧光基团进行区分（通常使用的是VIC和FAM），3’端标记不发荧光的淬灭基团NFQ（Q）。他们的序列中包含匹配不同基因型的碱基，碱基错配将导致探针与模板的结合能力大大降低，只有和目的片段碱基互补的探针才能结合并被水解释放荧光信号。

反应终止时测定所产生的荧光从扩增曲线就可以判断出样本的基因型，当基因型为纯合子时，只会检测到单独一种荧光信号，而对于杂合子，两种荧光信号都将被检测到。下图为不同样本获得的扩增曲线，我们可以清晰的判断出各样本所属的基因型。